Phim tập trung vào hai nhân vật chính là anh em nhà Winchester Sam Winchester (Jared Padalecki) và Dean Winchester (Jensen Ackles) theo suốt chuyến hành trình xuyên đất nước để truy tìm những thế lực siêu nhiên. Padalecki tỏ ra thích thú với vai diễn vì anh cảm giác phim có nét giống với The X-Files và Twilight Zone. Anh cảm nhận vai diễn Sam tương tự như Neo trong phim Ma trận và Luke Skywalker trong phim Chiến tranh giữa các vì sao. Trước đó, Padalecki cũng đã từng hợp tác với nhà chỉ đạo sản xuất McG và David Nutter,[46] nên họ đã mời anh thử vai.[47] Ban đầu Ackles được mời thử vai Sam,[48] nhưng sau khi đọc bản thảo anh quyết định chọn vai Dean.[45] Vào thời điểm thử vai, anh đang tham gia một bộ phim khác của hãng WB Smallville. Sau khi quyết định nhận vai Dean, vai diễn của anh trong Smallville được giảm bớt.[49]

Diễn viên chính của phim không nhiều, chỉ có hai anh em Sam và Dean, nhưng có rất nhiều diễn viên phụ. Jeffrey Dean Morgan thủ vai John Winchester, cha của Sam và Dean, xuất hiện trong tập đầu tiên Pilot, nhưng mãi đến giữa chừng của phần 1 ông mới tái diễn, rồi lại chỉ xuất hiện trong đoạn cái chết của nhân vật ở đầu và khúc cuối khi linh hồn ông quay về để giúp con trai mình ở phần 2. The John Shiban thì hai anh đã hoàn toàn tách biệt khỏi cha mình do đó tách biệt luôn cả bộ phim, ông phát biểu hai người con đi theo dấu vết của cha mình và đánh nhau với lũ quái bất chấp mọi cách ngăn và cản trở, họ vẫn tiếp tục. – Cha họ đang làm gì? Liệu rằng cha họ có làm được những điều họ đang làm hay không và như thế nào?[50] Mặc dù Morgan đang bận với vai diễn phụ trong phim Grey’s Anatomy, nhưng ông vẫn cố gắng quay trở lại vai diễn trong Supernatural.[51] Bởi vì thời khóa biểu của Morgan gần như chật kín nên sự trở lại trong vai diễn của ông rất khó nói trước được.[52]

Hai con quỷ đầu tiên xuất hiện trong phần 1 phim, Azazel và con quỷ nhập xác Meg Masters. Azazel thường xuất hiện dưới dạng cái bóng hoặc đám khói và có hình người khi nó nhập xác John Winchester, trong khi con quỷ kia thì dùng thân xác của cô gái có tên là Meg Masters (Nicki Lynn Aycox) để làm vật chủ. Người chọn Nicki cho vai diễn Meg là chỉ đạo sản xuất Kim Manners.[53] Trong phần 2, vật chủ của Azazel được Fredric Lehne thủ vai; theo đúng thì Lehne chỉ xuất hiện trong một tập, nhưng ông đã gây ấn tượng với ban điều hành do đó ông được mời tiếp tục đóng trong hai tập cuối của phần 2.[54] Azazel vẫn tiếp tục xuất hiện ngay cả khi nhân vật này đã chết ở phần 2, nhân vật tái diễn trong phần 4 do Christopher B. MacCabe thủ vai và Mitch Pileggi tập "In the Beginning" và phần cuối do Rob LaBelle đóng. Tương tự như vậy, mặc dù theo cốt truyện, nhân vật Meg Masters và con quỷ ám cô ta vẫn tiếp tục có mặt trong một vài tập tiếp theo. Con quỷ xuất hiện trong phần 2 khi nó nhập xác Sam và trong phần 5, trong vật chủ mới do Rachel Miner đóng. Còn Nicki đóng thêm cảnh Meg ở phần 4 khi quay về báo thù anh em nhà Winchesters.

Ý tưởng của các nhà biên kịch là muốn xoáy sâu vào phát triển hình tượng thợ săn, dẫn đến việc đưa thêm nhiều nhân vật mới vào phim.[55] Nam diễn viên Jim Beaver xuất hiện trong vai Bobby Singer ở cuối phần 1, một người bạn lâu năm của nhà Winchester, có thể nói là Bobby giống như người cha thứ hai của hai anh em Sam và Dean sau cái chết của cha họ,[56] nhân vật Bobby xuất hiện liên tục trong nhiều tập phim tiếp theo sau đó. Thợ săn khác trong phần 2 xuất hiện thêm tại quán Roadhouse của nhà Harvelle, giống như một điểm tập kết của thợ săn. Chủ quán là Ellen Harvelle(Samantha Ferris), chồng của bà là bạn của John Winchester, ở cùng bà còn có cô con gái Jo Harvelle (Alona Tal) và thiên tài tin học Ash (Chad Lindberg) với biệt tài là có thể dùng máy tính để truy tìm các sự kiện siêu nhiên.Tal là một nhân vật được thêm vào chứ không nằm trong kịch bản gốc, ban chỉ đạo sản xuất tin rằng nhân vật "Jo" giống như cô em gái 14 tuổi của Sam và Dean.[57] Kripke tuyên bố rằng cho thêm nhân vật "Jo" vào đã làm sai hướng của cốt truyện và phản ứng của người hâm mộ là thấp cho nhân vật này.[58] Nhân vật "Ash" kết thúc với cái chết của anh khi quán Roadhouse bị thêu rụi. Nhân vật Ellen đáng lẽ đã xuất hiện lại trong phần 3 nhưng đã bị đình lại do "Cuộc biểu tình của giới biên kịch Mỹ(2007-2008)".[59] Nhưng ban biên tậpvẫn dành cho nhân vật Ellen một vai ở những tập cuối phần 3,[60] nhưng Ferris không chấp thuận vì hợp đồng không có lợi cho bà, có thể nói là lỗ.[61] Tuy vậy, Jo và Ellen vẫn xuất hiện ở phần 5 của phim.

Trong phần 3, ban biên kịch quyết định thêm vào nhân vật mới Ruby, một mụ phù thủy hóa quỷ muốn trở thành đồng minh với anh em Winchester. Tuy nhiên, hãng CW muốn có thêm một nhân vật nữ nữa trong phim, và họ quyết định thêm vào Bela Talbot, một tên trộm chuyên trộm những vật ma thuật để bán cho khách hàng giàu có. Ban đầu đoàn làm phim chỉ định cho nhân vật Bela xuất hiện trong một vài tập, nhưng sau đó đã nâng lên nhân vật phụ trong nhiều tập.[62] Katie Cassidy và Lauren Cohan được chỉ định vào vai Ruby và Bela, theo kế hoạch ban đầu thì họ sẽ đóng vai của nhau trong hiện tại.[63] Mặc dù hai nhân vật chỉ xuất hiện 6 lần trong phim, nhưng cả hai đã chinh phục được khán giả. Riêng nhân vật Bela đã được bố trí chết trong cuối phần 3 do phản ứng tiêu cực từ khán giả,[64] còn Cassidy thì rút lui vì lý do tài chính.[65]Ruby xuất hiện trong phần 4 do Genevieve Cortese thủ vai[66] cho đến khi nhân vật này chết ở cuối phần 3.

Ban biên tập muốn tăng thêm tính truyền thuyết của Cơ đốc giáo trong phim, nên họ đã tạo ra nhân vật ‘’thiên thần’’ Castiel.[67] Trong đoạn mở đầu, vì muốn giữ bí mật về nhân vật nên Kripke đã để đoạn hội thoại giả định sự hoài nghi về nhân vật là một con quỷ đã cứu Dean.[68] Misha Collins tham gia đoàn phim và vào vai Castiel ở phần 4. Theo kịch bản, chính Castiel đã hồi sinh Dean sau khi anh chết ở cuối phần 3 và trở thành đồng minh của nhà Winchester. Ban đầu nhân vật chỉ được xác định xuất hiện trong sáu tập phim, nhưng đã được phát triển thêm sau đó.[69] Collins được giới thiệu như một trong những nhân vật chính của phim mà tin rằng chỉ để thỏa mãn sự hâm mộ của các khán giả.[70]

Bên cạnh Castiel, ban biên tập còn đưa thêm ‘’thiên thần’’ Uriel (Robert Wisdom) một thiên thần ‘’hiếu chiến’’ và ‘’cực đoan’’[71]; Julie McNiven vào vai ‘’thiên thần sa ngã’’ Anna Milton, người sau đó đã lấy lại được sức mạnh thiên thần nhưng vẫn là kẻ phản bội Thiên Đường; Kurt Fuller vào vai trưởng nhóm thiên thần Zachariah, người luôn muốn đem sự hủy diệt đến trái đất để xây dựng lại thiên đường trên trái đất. Mark Pellegrino vào vai Lucifer. Pellegrino đáng lẽ ra sẽ tham gia với vai Castiel,[72] nhưng rồi lại được chỉ định vào vai Lucifer mà không cần đóng thử.[73] Cuối phim, nhân vật Zachariah, Anna và mẹ con nhà Harvelle đều chết.

Bởi vì cả bộ phim tập trung quá nhiều vào hai anh em nhà Winchester nên ban biên tập nhận định rằng khán giả sẽ nghĩ rằng nhân vật chính sẽ không bao giờ chết, nên họ đã tăng thêm tình huống nguy hiểm, hồi hộp, và đôi lúc cho nhân vật chết tạm thời để gây hứng thú khi xem.[74]